OSTEXOMAR® NTX Urine 試劑盒說(shuō)明書(shū)（cat#9006）

酶聯(lián)免疫吸附法（EIA）定量檢測(cè)人尿液中I型膠原交聯(lián)氨基末端肽（NTX）

產(chǎn)品應(yīng)用：

Osteomark 用于定量測(cè)定分泌的交聯(lián)型I型膠原N端肽（NTX）。NTX是骨吸收的一種標(biāo)記物，尿液NTX水平的升高標(biāo)志著骨吸收水平的升高。NTX的測(cè)量用于以下用途：

A．預(yù)測(cè)絕經(jīng)后婦女用激素抗吸收治療的骨骼反應(yīng)（骨密度）。

B．治療監(jiān)測(cè)

1． 絕經(jīng)后婦女的抗吸收治療

2． 診斷為骨質(zhì)疏松癥人群的抗吸收治療

3． 診斷為佩吉特骨病人群（Paget’s Disease）的抗吸收治療

4． 雌激素治療監(jiān)測(cè)

C．發(fā)現(xiàn)對(duì)于絕經(jīng)婦女補(bǔ)鈣和激素治療一年后骨密度下降的可能性。

Osteomark 的檢測(cè)范圍是20~3000nM骨膠原當(dāng)量（BCE）

實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：

哺乳動(dòng)物通過(guò)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，伴隨由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成的連續(xù)過(guò)程，而不斷的重建，這個(gè)過(guò)程對(duì)骨骼的正常發(fā)育和維持是必須的，這個(gè)緊密結(jié)合的過(guò)程的異常往往導(dǎo)致骨量和形狀的改變。對(duì)特異的骨降解產(chǎn)物的測(cè)定，可以作為研究骨代謝率提供分析數(shù)據(jù)。

約90%的骨組織基質(zhì)是I型膠原，I型膠原是一種由C端和N端交聯(lián)的螺旋蛋白，這種蛋白組成了骨組織的基本結(jié)構(gòu)和張力。NTX(交聯(lián)型I型膠原C末端肽)的發(fā)現(xiàn)為骨吸收提供了一種特異的生化標(biāo)記物，這種標(biāo)記物可用于免疫檢測(cè)。NTX作為骨檢測(cè)特性分子，是由于其氨基酸序列和a2端肽的結(jié)構(gòu)方向。NTX分子的產(chǎn)生是由骨中破骨細(xì)胞介導(dǎo)的，作為一種穩(wěn)定的降解終產(chǎn)物存在于尿液中。

OSTEXOMAR®試劑盒用于定量測(cè)定尿液中的NTX。尿液中NTX水平的升高標(biāo)志著骨吸收水平的升高。骨吸收水平的升高是與年齡相關(guān)的骨量降低的首要原因。低骨量常常導(dǎo)致骨量減少，是骨質(zhì)疏松的主要原因。當(dāng)骨吸收水平高于骨形成水平時(shí)骨量降低。據(jù)報(bào)道，骨質(zhì)疏松性骨折是老年婦女發(fā)病率和死亡率升高的主要原因。

對(duì)接受激素治療（HRT）和補(bǔ)鈣（500mg/ 天）或僅進(jìn)行補(bǔ)鈣的絕經(jīng)婦女進(jìn)行了一次隨機(jī)、前瞻性的臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果支持用Osteomark的試劑盒預(yù)測(cè)的反應(yīng)和監(jiān)測(cè)抗吸收治療的效果。

用OSTEXOMAR®試劑盒監(jiān)測(cè)抗吸收治療的應(yīng)用，在一項(xiàng)用雙磷酸鹽（alendronate sodium, 10 mg）治療骨質(zhì)疏松病人的研究中得到了陳述。結(jié)果表明骨質(zhì)疏松病人在經(jīng)過(guò)三個(gè)月的治療后，其Osteomark值應(yīng)被控制在≤35 NM BCE/mM肌酐或者經(jīng)過(guò)3個(gè)月的治療后≥40%偏離于基線。

為了測(cè)定Osteomark試劑盒在監(jiān)測(cè)佩吉特骨病人（Paget’s Disease）抗吸收治療效果的能力，進(jìn)行了一項(xiàng)研究。Osteomark試劑盒基線值于治療開(kāi)始后于基線的變化率都于血清堿性磷酸酶總量相關(guān)。在治療效果上，Osteomark試劑盒檢測(cè)值用于早期治療后的早期評(píng)估?？刮罩委熑齻€(gè)月后，佩吉特骨病人（Paget’s Disease）應(yīng)偏離基值30%以上。

檢測(cè)原理：

OSTEXOMAR®試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定，用包被有NTX的微孔為固相，標(biāo)本中的NTX和固相中的NTX競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HRP標(biāo)記的NTX單克隆抗體。結(jié)合到固相上的抗體的量和結(jié)合到標(biāo)本中的NTX的抗體量成反比。標(biāo)本中NTX的濃度通過(guò)吸光度發(fā)測(cè)定。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出。稀釋的尿液測(cè)定通過(guò)肌酐分析校正，用nMBCE/mmol 肌酐/L表示。

試劑盒組成：

試劑說(shuō)明：

96孔板： 96孔（12x8）可拆板，包被有合成的NTX。

抗體：1瓶，純化的小鼠NTX單抗-HRP標(biāo)記（含保護(hù)劑）。100X濃縮液（0.4ml）

抗體稀釋液：1瓶，用于抗體稀釋（含保護(hù)劑）30ml。

30X洗液：30x濃縮洗液。

顯色劑：100x濃縮液（0.9ml）

底物緩沖液：過(guò)氧化氫緩沖液 (30ml)

終止液：1瓶，1N硫酸（25ml）

標(biāo)準(zhǔn)品：分析用標(biāo)準(zhǔn)品：1,30,100,300,1000,3000nM BCE（各0.4ml）。

質(zhì)控品：尿液質(zhì)控品I，II，各一管。

試劑保存：

試劑2-8℃保存，用前置于室溫平衡。不要將試劑置于30℃或者2℃以下環(huán)境中，稀釋后的洗滌液可在室溫存放1個(gè)月。

試劑盒不提供的設(shè)備/試劑：

1） 移液器

2） 槍頭

3） 塑料容器

4） 自動(dòng)洗板機(jī)

5） 酶標(biāo)儀

6） 曲線擬合軟件

7） 去離子水

尿標(biāo)本的收集保存：

1） 收集早晨的第二次晨尿或者24小時(shí)尿標(biāo)本，盛于密閉容器中。

2） 尿標(biāo)本中不要加保護(hù)劑

3） 帶血標(biāo)本或溶血標(biāo)本可能對(duì)測(cè)定造成影響，建議重新采集樣本。

4） 尿標(biāo)本2-8℃可以保存72小時(shí)，室溫可保存24小時(shí)，冷凍（≤20℃）可長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。

5） 監(jiān)測(cè)治療時(shí)，基準(zhǔn)標(biāo)本應(yīng)該在治療開(kāi)始前收集，后續(xù)收集的用于比較治療效果的標(biāo)本收集的時(shí)間應(yīng)與基準(zhǔn)標(biāo)本收集的時(shí)間一致。

注意事項(xiàng)

1） 僅供體外診斷用

2） 96孔板、標(biāo)準(zhǔn)品和尿液質(zhì)控品匯總含有從人尿液或骨組織提取的抗原，應(yīng)做適當(dāng)處理。

3） 終止液中含有1N硫酸，不要濺到皮膚或眼睛中。一旦被濺到，立即用水沖洗15分鐘，濺如如眼睛時(shí)要立即就醫(yī)。

4） 顯色幾種含有TMB和DMSO。DMSO易被皮膚吸收，吸入、寄出皮膚或吞咽多會(huì)造成傷害，一旦暴露，應(yīng)立即用流水沖洗暴露部位15 分鐘，如濺入眼中，立即就醫(yī)。

5） 尿液標(biāo)本中可能含有傳染源，應(yīng)做正確處理，用0.5%的次氯酸鈉溶液或121℃高壓消毒1小時(shí)。不要高壓次氯酸鈉的溶液，也不要將次氯酸鈉和酸混合。

6） 決不要用嘴吸試劑或臨床標(biāo)本。

7） 處理標(biāo)本和試劑時(shí)要穿防護(hù)衣，戴防護(hù)手套，用完后洗手。

8） 不要使用過(guò)效期試劑。

9） 不要將不同批號(hào)的試劑混合使用。

10）微孔板必須干燥保存，未使用的板條應(yīng)當(dāng)用盛有干燥劑的密封袋重新密封保存。

11）測(cè)定程序要在符合溫育要求的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行，測(cè)試中要避開(kāi)特殊的環(huán)境條件。

操作流程：

1.    測(cè)定前至少將標(biāo)本和試劑盒在室溫（18-28℃）平衡1小時(shí)。為了偏于加溫，將試劑從世紀(jì)合眾取出，冰凍狀態(tài)的尿標(biāo)本，可用水浴或溫育箱37℃解凍后，置于室溫。顯色幾種含有DMSO,冷凍后是有可能是固體，室溫狀態(tài)下是液體。

2.    制備1X的洗滌液。將30X的洗滌液用去離子水1:30稀釋（1份30X濃縮洗滌液+29份去離子水）。至少混勻5分鐘，稀釋后的洗滌液在室溫可保存1個(gè)月 。

3.    做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿標(biāo)本位置的孔排布圖。建議標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿標(biāo)本都做復(fù)孔，以下是測(cè)試4例樣本的排布圖。

4.    準(zhǔn)備一個(gè)一次性塑料容器,用抗體稀釋液1:101稀釋濃縮抗體。對(duì)于整塊板，建議：

取20ul的抗體濃縮液用2ml的抗體稀釋液去稀釋，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，不要渦旋混勻或用磁力攪拌。配好的抗體稀釋液1小時(shí)使用，容器不要重復(fù)使用。

5.    測(cè)定前輕輕混勻標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿液標(biāo)本，不要形成泡沫?；鞚針颖痉胖?/span>5-10分鐘再吸樣，含沉淀的尿標(biāo)本，用前請(qǐng)離心。

6.    取出需要數(shù)量板條，剩余放回密封袋，沿拉鏈密封，保留干燥劑。

標(biāo)本和抗體的孵育（測(cè)試開(kāi)始后，不要間斷）

7．根據(jù)步驟3種的孔排布，加入25ul的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、尿液標(biāo)本于相應(yīng)的微量孔中。

  加樣槍用前校準(zhǔn)，每次家養(yǎng)后需要換新的吸頭。

8.用排槍加入200ul的稀釋后的抗體，用封板膜封板，在平面上輕輕混勻5-10秒。

9.    室溫（18-28℃）孵育90±5分鐘。

10.  在溫育后的最后10min準(zhǔn)備顯色底物溶液，將顯色液（Chromogen）加入底物緩沖液（Buffered Subsrate）中。建議，如果是整版的，去20ul顯色液加入到2ml的底物緩沖液中。底物緩沖液加到一個(gè)一次性塑料容器中，將顯色液充分混勻后加到底物溶液中，輕輕混勻，不要?jiǎng)×覔u動(dòng)或使用磁力攪拌。配置的顯色底物緩沖液要在30分鐘內(nèi)使用。混勻后溶液應(yīng)當(dāng)是無(wú)色的，藍(lán)色表明試劑被污染，應(yīng)當(dāng)棄掉。配置顯色底物緩沖液的容器不可重復(fù)利用。

11.  溫育結(jié)束，小心揭去密封條，在自動(dòng)洗板機(jī)上用洗液洗板5次，每次沖洗循環(huán)沒(méi)空最少350ul洗液。洗板過(guò)程中，每孔中應(yīng)加滿洗滌液。沖洗結(jié)束，倒置板，在吸水紙上排干。立即加入上述配好的顯色底物緩沖液。

顯色和測(cè)定

12.  用排槍取200ul第10步配置好的顯色底物緩沖液加入到各孔。用封板膜封板。

13.  室溫孵育15±1分鐘，結(jié)合有HRP標(biāo)記抗體的孔會(huì)有藍(lán)色顯色。

14.  孵育結(jié)束后，小心揭去封板膜。用排槍加入100ul終止液，孔內(nèi)顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。

15.  在平面上將微孔板輕輕旋轉(zhuǎn)混勻5-10秒，室溫繁殖5分鐘后測(cè)吸光度值。

16.  加入終止液后30分鐘內(nèi)，酶標(biāo)儀讀取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控和樣本吸光度值。主波長(zhǎng)450nm,副波長(zhǎng)630nm，酶標(biāo)儀應(yīng)能保證最大OD≥3.0。

結(jié)果分析：

1.采用4參數(shù)曲線擬合的方式，做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本和質(zhì)控的濃度值（nM BCE）。

2.結(jié)果在滿足以下條件下是有效的：

1）1nM BCE標(biāo)準(zhǔn)品的平均OD值必須≥1.5

2）1nM BCEE標(biāo)準(zhǔn)品OD值和3000NM BCE標(biāo)準(zhǔn)品OD值相差應(yīng)≥1.3

3）樣本復(fù)孔間的變異系數(shù)（CV%）應(yīng)≤20%。樣本，CV%≥20%的應(yīng)該重測(cè)。

4)檢測(cè)值20 nM BCE(不包括肌酐調(diào)整值)

5）樣本濃度超過(guò)3000nM BCE需要用200-500nm BCE的尿樣做1:5稀釋后再測(cè)。當(dāng)用樣本做稀釋液時(shí)，這個(gè)稀釋液的nm BCE也要在同一塊板上測(cè)定出來(lái)。稀釋倍數(shù)和背景（稀釋液的nm BCE值）也要合并計(jì)算。

例如：用測(cè)值是300nM BCE的尿液做稀釋液，以1:5的比例稀釋4000 nMBCE的樣本，測(cè)值為：1040nM BCE。

1040 nM BCE - (0.8 x 300 nM BCE) = 800 nM BCE

800 nM BCE x 5 (稀釋倍數(shù)) = 4000 nM BCE

注：1:5稀釋表示稀釋液（作為稀釋液的尿液中）的NTX 占20%

6） 檢測(cè)報(bào)告的測(cè)值用：nM BCE/ mM肌酐表示，例如：

測(cè)定值：360 nM BCE

尿肌酐值：60mg/dL肌酐/11.3（轉(zhuǎn)化因子）=5.3mM肌酐

360 nM BCE/5.3 mM肌酐=68 nM BCE/ mM肌酐

注：11.3(轉(zhuǎn)化因子)：將毫克/分升（dL）轉(zhuǎn)換為毫摩爾/L的轉(zhuǎn)化因子。

7.    廠家建立了自己的質(zhì)控范圍，建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立自己的質(zhì)控范圍。

局限性：

雖然NTX被用作骨吸收檢測(cè)標(biāo)記物，但尚未用于預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥的形成和未來(lái)發(fā)生骨折的風(fēng)險(xiǎn)，也未用于診斷原發(fā)性甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)。當(dāng)用該試劑盒監(jiān)測(cè)治療效果時(shí)，可能會(huì)受到影響骨吸收的其他臨床條件的影響。例如：骨轉(zhuǎn)移。由于報(bào)告結(jié)果不包含時(shí)間因素，單一的Osteomark值不能提供骨吸收率。其結(jié)果應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床和其他診斷結(jié)果綜合分析。

干擾物質(zhì)：

對(duì)尿液中各種可能對(duì)測(cè)定造成干擾的成份和微生物進(jìn)行了評(píng)估。已檢測(cè)微生物，如：大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、白色假絲酵母菌（ATCC 14053）都對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，人白蛋白、膽紅素、糖和維生素C對(duì)測(cè)定也無(wú)干擾。血尿標(biāo)本和溶血標(biāo)本可能對(duì)測(cè)定造成干擾，應(yīng)棄掉，重新采樣。

預(yù)測(cè)值

表1：男性和絕經(jīng)前婦女測(cè)值預(yù)期范圍

絕經(jīng)前婦女的預(yù)期值范圍經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后為：14-74nM BCE/mM肌酐

男性參考范圍為：13-78nM BCE/mM肌酐

從對(duì)健康絕經(jīng)后婦女（n=276,268）和30歲以上的男人（n=36,35）的研究中確立了短期和長(zhǎng)期的變異。連續(xù)收集3-4天尿標(biāo)本測(cè)定短期變異，連續(xù)收集2-3個(gè)月尿標(biāo)本測(cè)定長(zhǎng)期變異。短期變異：婦女15%， 男男子：18%。長(zhǎng)期變異：婦女18%， 男性19%

重復(fù)性和精密度：

批內(nèi)差異：由4個(gè)操作者分別對(duì)8份尿液標(biāo)本重復(fù)測(cè)定10次而評(píng)估的。結(jié)果如下：

批間差異：由一個(gè)操作者對(duì)3分尿標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次，進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如下：

精密度：是通過(guò)30天中在3家臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定尿液質(zhì)控品I和尿液質(zhì)控品II進(jìn)行評(píng)價(jià)的。尿液質(zhì)控品I的均值為439 nM BCE，變異系數(shù)為10%，尿液質(zhì)控品II的均值為1537 nM BCE，變異系數(shù)為7%。

抗原回收：

抗原回收是通過(guò)向3份已知NTX濃度的尿標(biāo)本中加入已知量的NTX來(lái)評(píng)價(jià)?；厥毡硎緶y(cè)得值占理論值（尿液基準(zhǔn)值加新加入的抗原（NTX）值）的百分比，結(jié)果抗原回收率是105%。

線性檢測(cè)：

稀釋線性是通過(guò)對(duì)4分高nM BCE的尿液標(biāo)本用200-500 nM BCE的尿液標(biāo)本做系列稀釋來(lái)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)r=0.999 或 r=1.0000

注：中文譯文僅供參考，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)