小鼠總IgE抗體檢測(cè)試劑盒

Mouse Total IgE (IgEa and IgEb) Detection ELISA Kit

Ca#3005

背景簡(jiǎn)介：

Ⅰ型超敏反應(yīng)是一種典型的過敏性疾病，如哮喘、濕疹、花粉熱、蕁麻疹等。這種超敏反應(yīng)是由IgE抗體介導(dǎo)的。IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的高親和力IgE受體（FcεRI）結(jié)合，并通過FcεRI（1）的穩(wěn)定和積累顯著上調(diào)FcεRI的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)過敏原的超敏反應(yīng)。與細(xì)胞表面IgE抗體結(jié)合的特異性變應(yīng)原交聯(lián)FcεRI（2-3），引起肥大細(xì)胞的刺激和脫顆粒。這與多種促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放有關(guān)，如組胺、蛋白水解酶、肝素和趨化因子，這些都會(huì)導(dǎo)致與I型超敏反應(yīng)相關(guān)的癥狀。在過敏性疾病和寄生蟲感染的疾病中，血清IgE抗體水平通常會(huì)升高。盡快血清IgE水平不能單獨(dú)反應(yīng)患者的過敏狀態(tài)和臨床癥狀，但是很明顯血清IgE水平升高有助于診斷人類的這些疾病。

試劑盒組分：

 檢測(cè)流程：

1)加入100ul 稀釋后的捕獲抗體到各孔。

2）4℃孵育過夜，洗板。

3）加入100ul稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。

4）室溫孵育2小時(shí)，洗板。

5）加入100ul稀釋后的檢測(cè)抗體。

6）室溫孵育1小時(shí)，洗板。

7）加入100ul吸收后的鏈親和素-HRP。

8）室溫孵育1小時(shí)，洗板。

9）加入100ul TMB顯色液

10）室溫孵育25min

11)加入50ul終止液

12）讀取450nm/630nm吸光度值

注意事項(xiàng)：

1. 建議樣本、標(biāo)準(zhǔn)品均做復(fù)孔檢測(cè)
2. 用前所有的緩沖液置于室溫平衡
3. 20X洗滌液低溫可能會(huì)有結(jié)晶析出。如果有結(jié)晶析出，把洗滌液瓶置于溫水中直至結(jié)晶*溶解。
4. 用移液器準(zhǔn)確定量提供的緩沖液，提供額外的緩沖液。
5. 每個(gè)步驟結(jié)束后，用封板膜封板，防止蒸發(fā)。
6. 如果只是用部分試劑，請(qǐng)參照操作步驟中的用量，做相應(yīng)的使用量緩沖液配制。未使用的儲(chǔ)液在原包裝管內(nèi)保存，置于-20℃保存。
7. 正常小鼠總IgE水平大概在50-100ng/ml,氫氧化鋁佐劑免疫2周后，抗體水平提高到ug/ml。隨后用抗原免疫后增加至10-20ug/ml。

操作流程：

1.加入包被抗體：用10ml包被抗體稀釋液（Solution A）稀釋1管包被抗體?；蛘吒鶕?jù)用量按下表稀釋。加入100ul稀釋后的包被抗體液到各孔，4℃過夜孵育。剩余包被抗體儲(chǔ)液-20℃凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.制備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：推薦的標(biāo)準(zhǔn)品范圍是1.6-100ng/ml。用樣本/標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（Solution）1ml稀釋1管標(biāo)準(zhǔn)品（100ng/管），制備100ng/mlIgE標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液，隨后用稀釋液做系列稀釋，制備：100ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.3ng/ml, 3.1ng/ml, 1.6ng/ml。剩余的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液（100ng/ml）可以-20℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。建議您每次實(shí)驗(yàn)室，制備新鮮標(biāo)準(zhǔn)品。

3.制備稀釋樣本：正常血清推薦稀釋比是1:10-1:50。免疫過的小鼠血清稀釋比從：1:100~1:1000，具體取決于免疫程序和血清樣本收集時(shí)間。

4.洗滌緩沖液稀釋：用950ml雙蒸水（1x洗液）稀釋50ml 20x洗液。用1x稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

5.加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本：加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品，SolutionB(空白)和樣本到對(duì)應(yīng)孔（做復(fù)孔。）室溫孵育2小時(shí)。

6.洗滌：用1x稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

7.加入檢測(cè)抗體：用10ml檢測(cè)抗體稀釋液（SolutionC）稀釋1管檢測(cè)抗體?；蛘哂?span>50ul SolutionC稀釋1管檢測(cè)抗體，按表格里需求量稀釋。加入100ul抗體抗體稀釋液到各孔，室溫孵育1小時(shí).

8.洗滌：用1X稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

9.加入鏈霉親和素-HRP:用10ml鏈霉親和素稀釋液(Solution D)稀釋1管鏈霉親和素-HRP。加入100ul稀釋后的鏈霉親和素稀釋液到各孔，室溫孵育1小時(shí)。

10.洗滌：用1X稀釋洗板至少三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

11.加入TMB:用新管制備TMB。用前10ml底物稀釋液一管TMB。加入100ulTMB稀釋液到各孔，室溫孵育25min。

12.終止：加入50ul 2N硫酸（終止液）到各孔。

13.讀板：讀取450nm OD值。如果樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品高OD值，樣本稀釋后重新檢測(cè)。630nm波長(zhǎng)，檢測(cè)的副波長(zhǎng)。

結(jié)果計(jì)算：

1.計(jì)算空白孔、樣本和標(biāo)準(zhǔn)品OD值的平均值。

2.用標(biāo)準(zhǔn)品和樣本OD均值減去空白孔OD值。

3.用標(biāo)準(zhǔn)OD值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Log/Log擬合曲線。見圖例1.

4.通過回歸曲線計(jì)算樣本中濃度值，通過乘稀釋倍數(shù)得到樣本的原始濃度值